Сахарозная методика

Раздражители

По природе раздражители подразделяют на:

  • физические (звук, свет, температура, вибрация, осмотическое давление), особое значение для биологических систем имеют электрические раздражители;
  • химические (ионы, гормоны, нейромедиаторы, пептиды, ксенобиотики);
  • информационные (голосовые команды, условные знаки, условные стимулы).

По биологическому значению раздражители подразделяют на:

  • адекватные – раздражители, для восприятия которых биологическая система имеет специальные приспособления;
  • неадекватные – раздражители, не соответствующие природной специализации рецепторных клеток, на которые они действуют.

Раздражитель вызывает возбуждение только в том случае, если он достаточно силен. Порог возбуждения – минимальная сила раздражителя, достаточная для того, чтобы вызвать возбуждение клетки. Выражение «порог возбуждения» имеет несколько синонимов: порог раздражения, пороговая сила раздражителя, порог силы.

Возбуждение как активная реакция клетки на раздражитель

Реакция клетки на внешнее воздействие (раздражение) отличается от реакции небиологических систем следующими особенностями:

  • энергией для реакции клетки служит не энергия раздражителя, а энергия, образующаяся в результате метаболизма в самой биологической системе;
  • сила и форма реакции клетки не определяется силой и формой внешнего воздействия (если сила раздражителя выше пороговой).

В некоторых специализированных клетках реакция на раздражитель проявляется особенно интенсивно. Такую интенсивную реакцию называют возбуждением. Возбуждение – активная реакция специализированных (возбудимых) клеток на внешнее воздействие, проявляющаяся в том, что клетка начинает выполнять присущие ей специфические функции.

Возбудимая клетка может находиться в двух дискретных состояниях:

  • состоянии покоя (готовность к реагированию на внешнее воздействие, совершение внутренней работы);
  • состоянии возбуждения (активное выполнение специфических функций, совершение внешней работы).

В организме существует 3 типа возбудимых клеток:

  • нервные клетки (возбуждение проявляется генерацией электрического импульса);
  • мышечные клетки (возбуждение проявляется сокращением);
  • секреторные клетки (возбуждение проявляется выбросом в межклеточное пространство биологически активных веществ).

Возбудимость – способность клетки переходить из состояния покоя в состояние возбуждения при действии раздражителя. Разные клетки имеют различную возбудимость. Возбудимость одной и той же клетки меняется в зависимости от ее функционального состояния.

Возбудимая клетка в состоянии покоя

Мембрана возбудимой клетки поляризована. Это означает, что имеется постоянная разность потенциалов между внутренней и наружной поверхностью клеточной мембраны, которую называют мембранный потенциал (МП). В состоянии покоя величина МП составляет –60…–90 мВ (внутренняя сторона мембраны заряжена отрицательно относительно наружной). Значение МП клетки в состоянии покоя называют потенциалом покоя (ПП). МП клетки можно измерять, разместив один электрод внутри, а другой снаружи клетки.

Уменьшение МП относительно его нормального уровня (ПП) называют деполяризацией, а увеличение – гиперполяризацией. Под реполяризацией понимают восстановление исходного уровня МП после его изменения.

 

 

Электрические и физиологические проявления возбуждения

Рассмотрим различные проявления возбуждения на примере раздражения клетки электрическим током.

При действии слабых (подпороговых) импульсов электрического тока в клетке развивается электротонический потенциал. Электротонический потенциал (ЭП) – сдвиг мембранного потенциала клетки, вызываемый действием постоянного электрического тока . ЭП есть пассивная реакция клетки на электрический раздражитель; состояние ионных каналов и транспорт ионов при этом не изменяется. ЭП не проявляется физиологической реакцией клетки. Поэтому ЭП не является возбуждением.

При действии более сильного подпорогового тока возникает более пролонгированный сдвиг МП – локальный ответ. Локальный ответ (ЛО) – активная реакция клетки на электрический раздражитель, однако состояние ионных каналов и транспорт ионов при этом изменяется незначительно. ЛО не проявляется заметной физиологической реакцией клетки. ЛО называют местным возбуждением, так как это возбуждение не распространяется по мембранам возбудимых клеток.

При действии порогового и сверхпорогового тока в клетке развивается потенциал действия (ПД). ПД характеризуется тем, что значение МП клетки очень быстро уменьшается до 0 (деполяризация), а затем мембранный потенциал приобретает положительное значение  (+20…+30 мВ), т. е. внутренняя сторона мембраны заряжается положительно относительно наружной.

Затем значение МП быстро возвращается к исходному уровню. Сильная деполяризация клеточной мембраны во время ПД приводит к развитию физиологических проявлений возбуждения (сокращение, секреция и др.). ПД называют распространяющимся возбуждением, поскольку, возникнув в одном участке мембраны, он быстро распространяется во все стороны.

Механизм развития ПД практически одинаков для всех возбудимых клеток. Механизм сопряжения электрических и физиологических проявлений возбуждения различен для разных типов возбудимых клеток (сопряжение возбуждения и сокращения, сопряжение возбуждения и секреции).

Устройство клеточной мембраны

В механизмах развития возбуждения участвуют 4 вида ионов: K+ , Na+ , Ca++ , Cl – (ионы Ca++ участвуют в процессах возбуждения некоторых клеток, например кардиомиоцитов, а ионы Cl – важны для развития торможения). Мембрана клетки, представляющая собой липидный бислой, непроницаема для этих ионов. В мембране существуют 2 типа специализированных интегральных белковых систем, которые обеспечивают транспорт ионов через клеточную мембрану: ионные насосы и ионные каналы.

Ионные насосы и трансмембранные ионные градиенты

Ионные насосы (помпы) – интегральные белки, которые обеспечивают активный перенос ионов против градиента концентрации. Энергией для транспорта служит энергия гидролиза АТФ. Различают Na+ / K+ помпу (откачивает из клетки Na+ в обмен на К+ ), Ca++ помпу (откачивает из клетки Ca++), Cl– помпу (откачивает из клетки Cl – ).В результате работы ионных насосов создаются и поддерживаются трансмембранные ионные градиенты:

  • концентрация Na+, Ca++, Cl – внутри клетки ниже, чем снаружи (в межклеточной жидкости);
  • концентрация K+ внутри клетки выше, чем снаружи.

Ионные каналы

Ионные каналы – интегральные белки, которые обеспечивают пассивный транспорт ионов по градиенту концентрации. Энергией для транспорта служит разность концентрации ионов по обе стороны мембраны (трансмембранный ионный градиент).

Неселективные каналы обладают следующими свойствами:

  • пропускают все типы ионов, но проницаемость для ионов K+ значительно выше, чем для других ионов;
  • всегда находятся в открытом состоянии.

Селективные каналы обладают следующими свойствами:

  • пропускают только один вид ионов; для каждого вида ионов существует свой вид каналов;
  • могут находиться в одном из 3 состояний: закрытом, активированном, инактивированном.

Избирательная проницаемость селективного канала обеспечивается селективным фильтром, который образован кольцом из отрицательно заряженных атомов кислорода, которое находится в самом узком месте канала.

Изменение состояния канала обеспечивается работой воротного механизма, который представлен двумя белковыми молекулами. Эти белковые молекулы, так называемые активационные ворота и инактивационные ворота, изменяя свою конформацию, могут перекрывать ионный канал.

В состоянии покоя активационные ворота закрыты, инактивационные ворота открыты (канал закрыт). При действии на воротную систему сигнала активационные ворота открываются и начинается транспорт ионов через канал (канал активирован). При значительной деполяризации мембраны клетки инактивационные ворота закрываются и транспорт ионов прекращается (канал инактивирован). При восстановлении уровня МП канал возвращается в исходное закрытое) состояние.

В зависимости от сигнала, который вызывает открытие активационных ворот, селективные ионные каналы подразделяют на:

  • хемочувствительные каналы – сигналом к открытию активационных ворот является изменение конформации ассоциированного с каналом белка-рецептора в результате присоединения к нему лиганда;
  • потенциалчувствительные каналы – сигналом к открытию активационных ворот является снижение МП (деполяризация) клеточной мембраны до определенного уровня, который называют критическим уровнем деполяризации (КУД).

Механизм формирования потенциала покоя

Мембранный потенциал покоя образуется главным образом благодаря выходу К+ из клетки через неселективные ионные каналы. Утечка из клетки положительно заряженных ионов приводит к тому, что внутренняя поверхность мембраны клетки заряжается отрицательно относительно наружной.  Мембранный потенциал, возникающий в результате утечки К+ , называют «равновесным калиевым потенциалом» (Ек). Его можно рассчитать по равнению Нернста

 

 

где R – универсальная газовая постоянная,

Т – температура (по Кельвину),

F – число Фарадея,

[К+] нар – концентрация ионов К+ снаружи клетки,

[К+] вн – концентрация ионов К+ внутри клетки.

ПП, как правило, очень близок к Ек, но не точно равен ему. Эта разница объясняется тем, что свой вклад в формирование ПП вносят:

  • поступление в клетку Na+ и Cl– через неселективные ионные каналы; при этом поступление в клетку Cl– дополнительно гиперполяризует мембрану, а поступление Na+ – дополнительно деполяризует ее; вклад этих ионов в формирование ПП невелик, так как проницаемость неселективных каналов для Cl– и Na + в 2,5 и 25 раза ниже, чем для К+;
  • прямой электрогенный эффект Na+ /К+ ионного насоса, возникающий в том случае, если ионный насос работает асимметрично (количество переносимых в клетку ионов K+ не равно количеству выносимых из клетки ионов Na+).

Механизм развития потенциала действия

В потенциале действия выделяют несколько фаз:

  1. фаза деполяризации;
  2. фаза быстрой реполяризации;
  3. фаза медленной реполяризации (отрицательный следовый потенциал);
  4. фаза гиперполяризации (положительный следовый потенциал).

Фаза деполяризации. Развитие ПД возможно только при действии раздражителей, которые вызывают деполяризацию клеточной мембраны. При деполяризации клеточной мембраны до критического уровня деполяризации (КУД) происходит лавинообразное открытие потенциалчувствительных Na+-каналов. Положительно заряженные ионы Na+ входят в клетку по градиенту концентрации (натриевый ток), в результате чего мембранный потенциал очень быстро уменьшается до 0, а затем приобретает положительное значение. Явление изменения знака мембранного потенциала называют реверсией заряда мембраны.

Фаза быстрой и медленной реполяризации . В результате деполяризации мембраны происходит открытие потенциалчувствительных К+ -каналов. Положительно заряженные ионы К+ выходят из клетки по градиенту концентрации (калиевый ток), что приводит к восстановлению потенциала мембраны. В начале фазы интенсивность калиевого тока высока и реполяризация происходит быстро, к концу фазы интенсивность калиевого тока снижается и реполяризация замедляется.

Фаза гиперполяризации развивается за счет остаточного калиевого тока и за счет прямого электрогенного эффекта активировавшейся Na+ / K+ помпы.

Овершут – период времени, в течение которого мембранный потенциал имеет положительное значение.

Пороговый потенциал – разность между мембранным потенциалом покоя и критическим уровнем деполяризации. Величина порогового потенциала определяет возбудимость клетки – чем больше пороговый потенциал, тем меньше возбудимость клетки.

Раствор Кребса

Раствор Кребса-Рингера — сложный физиологический раствор, применяется в медицине, в физиологии для изучения деятельности тканей вне органов, для перфузии изолированных органов. 

Ингредиент

 %

NaCl

0,692

KCl

0,035

CaCl2

0,028

NaHCO3

0,010

KH2PO4

0,016

MgSO4·7H2O

0,029

Глюкоза

0,100

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Физиологический раствор — раствор, осмотическое давление   которого равно осмотическому давлению крови. Существует несколько типов физиологических растворов, состав которых зависит от целей, для которых они применяются. Наиболее часто применяемыми физиологическими растворами являются раствор Рингера — Локка, раствор Рингера — Тироде,  раствор Рингера — Рингера.

При приготовлении растворов соли добавляются последовательно, прибавляя каждую последующую соль только после растворения предыдущей. Глюкозу добавляют в растворы непосредственно перед применением. Все растворы готовят на свежей дистиллированной воде, перегнанной в стеклянной аппаратуре (металлы оказывают значительное влияние на жизнедеятельность тканей).

Глюкоза («виноградный сахар», Декстроза) встречается в соке многих фруктов и ягод, в том числе и винограда, отчего и произошло название этого вида сахара. Является шестиатомным сахаром (гексозой).

В организме человека и животных глюкоза является основным и наиболее универсальным источником калорийной энергии для обеспечения метаболических процессов, «единой энергетической валютой» организма. Способностью усваивать глюкозу обладают все клетки организма животных.

Транспорт глюкозы из внешней среды внутрь животной клетки осуществляется путём активного трансмембранного переноса с помощью особой белковой молекулы — переносчика (транспортёра) гексоз.

Глюкоза в клетках может подвергаться гликолизу с целью получения энергии в виде АТФ. Первым ферментом в цепи гликолиза является гексокиназа. Активность гексокиназы клеток находится под регулирующим влиянием гормонов — так, инсулин резко повышает гексокиназную активность и, следовательно, утилизацию глюкозы клетками, а глюкокортикоиды понижают гексокиназную активность.

Многие отличные от глюкозы источники энергии могут быть непосредственно конвертированы в печени в глюкозу — например, молочная кислота, многие свободные жирные кислоты и глицерин, или свободные аминокислоты, прежде всего, наиболее простые из них, такие, как аланин. Процесс образования глюкозы в печени из других соединений называется глюконеогенезом.

Те источники энергии, для которых не существует пути непосредственного биохимического превращения в глюкозу, могут быть использованы клетками печени для выработки АТФ и последующего энергетического обеспечения процессов глюконеогенеза, ресинтеза глюкозы из молочной кислоты, либо энергообеспечения процесса синтеза запасов полисахарида гликогена из мономеров глюкозы. Из гликогена путём простого расщепления опять-таки легко производится глюкоза.

В связи с исключительной важностью поддержания стабильного уровня глюкозы в крови, у человека и многих других животных существует сложная система гормональной регуляции параметров углеводного обмена.

Сахарозная методика изучения механической и электрической активности ткани человека и животных

Схема экспериментальной установки для изучения изолированных сосудов в режиме стабилизированного давления механической и электрической активности сосудов человека и животных:

 

  1.  Емкость №1 и №5 – раствор Кребса
  2. Емкость №2 и №4 – раствор сахарозы
  3. Емкость №3 – сосуд с раствором Кребса и добавляемых компонентов
  4. Термостат для поддержания температуры 370С

Электрическая схема установки

  1. Компьютер с АЦП/ЦАП;
  2. Принтер
  3. Скоростной самописец
  4. Датчик для измерения силы сжатия сосудов;
  5. Регистрирующие электроды №2 и №3
  6. Стимулирующий электрод №1;
  7. Камера №1 и №5 для установки электродов
  8. Камера №2 и №4 – раствор сахарозы
  9. Камера №3 – для исследований воздействий

 

Результаты исследований

В качестве исследуемой ткани бралось:

  1. Воротная вена крысы
  2. Сосуды человека непосредственно после вскрытия

В результате исследований было установлено:

  1. Любому механическому сокращению сосудов предшествует электрическая активность
  2. Механическая активность отсутствует, если из раствора Кребса удалить Ca.
  3. Добавление различных препаратов в исследуемой камере приводило к изменению потенциала и приводило к определенному сокращению сосудов

Влияние внутриклеточного потенциала при спонтанной активности сосудов с раствором Кребса содержащий Ca.

Влияние внутриклеточного потенциала при спонтанной активности сосудов с раствором Кребса не содержащий Ca.

 Перспективы дальнейшего развития

Эту методику исследований можно применять в дальнейшем, применив современные микропроцессорные контроллеры, что позволит:

  • Повысить точность и достоверность измерений;
  • Возможность изучения воздействия различных препаратов, а также их противопоказания
  • Исследовать в реальном времени заражение артерии коронавирусом
  • Исследовать пораженные коронавирусом мышцы
  • Исследовать влияние положительных и отрицательных зарядов на коронавирус .